La decorazione pittorica venne concepita in stretto rapporto con le proporzioni architettoniche della cappella, assecondando la scansione delle pareti. Le partizioni si basano infatti sulla scansione delle finestre, che genera lo spazio per sei riquadri sotto ciascuna finestra delle pareti laterali e per due in quelle frontale e posteriore.

Verticalmente gli affreschi sono ripartiti in tre registri: uno inferiore con finti tendaggi, per la cui decorazione vennero poi eseguiti gli arazzi di Raffaello; uno intermedio con le Storie di Mosè e Aronne sul lato sinistro e le Storie di Gesù sul lato destro, con fitti rimandi tra una parete e l'altra; uno superiore, oltre un cornicione fortemente sporgente, che coincide con il livello delle finestre e che a sua volta è divisibile in due sottoregistri: uno con le figure dei primi pontefici (da Pietro a Marcello) entro nicchie ai lati delle finestre e uno, oltre un'altra cornice aggettante, delle lunette affrescate poi da Michelangelo. Anche la parete di fondo presentava uno schema simile, con al centro, in corrispondenza dell'altare, una pala affrescata dal Perugino con l'Assunta, a cui era dedicata la cappella, venerata da Sisto IV in ginocchio.

Le corrispondenze tra le coppie simmetriche di riquadri tra una parete e l'altra, in base all'iconografia tipologica, sono esplicitate dalle iscrizioni (tituli) nel fregio soprastante: l'antico prefigura il nuovo e il nuovo si perfeziona dall'antico, secondo un concetto già espresso da sant'Agostino: «Dio, ispiratore e autore dei libri dell'uno e dell'altro Testamento, ha sapientemente disposto che il nuovo fosse nascosto nell'antico e l'antico diventasse chiaro nel nuovo».

Il messaggio sottinteso è quindi come Mosè, prima guida e legislatore del popolo eletto, con l'aiuto del sacerdote Aronne, prefiguri il Cristo, all'insegna della continuità della legge divina che, nel rinnovarsi delle leggi mosaiche nel nuovo patto del messaggio evangelico, viene poi trasmessa da Gesù a san Pietro e ai suoi successori, cioè i pontefici stessi. In questo senso aveva un ruolo fondamentale la scena della Consegna delle chiavi, affidata al Perugino, che testimonia il passaggio di tali poteri; sul lato opposto la Punizione di Quorah e dei suoi figli, di Botticelli, allude invece alla punizione che spetta a chiunque si opponga all'autorità del pontefice. Si tratta dunque di una solenne riaffermazione di natura politica e dottrinale del primato di san Pietro, della sua sacralità, intangibilità e della pienezza dei poteri del pontefice.

Il ciclo della Sistina rappresenta una gigantesca storia spirituale dell'Umanità: dalla Creazione al Peccato, alla Redenzione, alla Fine del Mondo. Gli affreschi delle pareti sono una rappresentazione del Regno della Legge e di quello della Grazia, resi con un tono commemorativo e agiografico. Michelangelo intese la creazione e il peccato come drammi dell'umanità intera, e la Redenzione un atto di speranza e di fede che si realizza in ogni momento e luogo. La dottrina neoplatonica, presente nella sua formazione culturale, lo conduce ad una profonda spiritualità interiore. Le varie figurazioni hanno, oltre che un significato letterale (Storie del popolo eletto), una più universale funzione di rivelazione degli stati d'animo dell'uomo dopo il Peccato: la tristezza della inconsapevole attesa (Antenati di Cristo), la cieca speranza di fronte al miracolo (Salvazioni di Israele), la virile serenità della coscienza del futuro (Profeti e Sibille).